Как сделать споровую взвесь из отпечатка
Добавил пользователь Дмитрий К. Обновлено: 05.10.2024
Фадейкина О.В. 1 Касина И.В. 1 Алексеева С.А. 1 Ковтун В.П. 1 Бурдина Е.Н. 1 Ермолаева Т.Н. 1 Саяпина Л.В. 1 Климов В.И. 1 Давыдов Д.С. 1 Немировская Т.И. 1 Мовсесянц А.А. 1 Волкова Р.А. 1 Борисевич И.В. 1 Бондарев В.П. 1
Вопросы стандартизации препаратов для профилактики особо опасных инфекций (ООИ), в связи с сохраняющейся возможностью их распространения, являются актуальными. Оценку общей концентрации микробных клеток большинства живых вакцин для профилактики ООИ проводят с использованием отраслевого стандартного образца (ОСО) мутности бактериальных взвесей (10 МЕ). Представлены материалы оценки общей концентрации микробных клеток во взвесях микроорганизмов Y. pestis, B. anthracis (споровая форма) и B. abortus с применением ОСО мутности (10 МЕ). Определен порядок применения и установлены значения пересчетных коэффициентов для чумного (0,95±0,24 млрд. м.к./мл) и споровой формы сибиреязвенного (0,11±0,06 млрд. м.к./мл) микробов, соответствующие мутности 10 МЕ.
2. МУ 3.3.2.2124-06 Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза: методические указания. – М., 2006. – 22 с.
3. Попов Н.В., Безсмертный В.Е., Матросов А.Н. и др. Эпизоотическая активность природных очагов чумы Российской Федерации в 2014 г. и прогноз на 2015 г. // Проблемы особо опасных инфекций. – 2015. – № 1. – С. 10-17.
5. Рязанова А.Г., Цыганкова О.И., Аксенова Л.Ю. и др. Эпидемиологическая и эпизоотологическая ситуация по сибирской язве в 2014 г., прогноз на 2015 г. // Проблемы особо опасных инфекций. – 2015. – № 1. – С. 26-29.
8. Саяпина Л.В., Абдрашитова А.С., Лобач Р.Н., Комратов А.В. и др. Диагностическая эффективность иммуноглобулинов флуоресцирующих вегетативных адсорбированных по данным медицинских исследований // Проблемы особо опасных инфекций. – 2012. – Выпуск №1 (114). – С. 92-96.
9. Фихман Б.А. Оптическая стандартизация бактерийных препаратов. – М.: Бюро научной информации, 1960. – 264 с.
10. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Second edition. Volume three. The Firmicutes. – Springer, New York. 2009.
Введение
Эпидемиологическая и эпизоотологическая ситуация по распространению особо опасных инфекций (ООИ) в Российской Федерации и в мире в 2014 г оценивалась как неблагополучная [3,5]. На 2015 г в некоторых регионах Российской Федерации специалисты прогнозируют сохранение напряженной эпидемиологической обстановки в отношении чумы и сибирской язвы, в связи с чем вопросы стандартизации препаратов для профилактики ООИ являются актуальными [8].
ОСО мутности был разработан в 60-х годах прошлого века в ГИСК им. Л.А. Тарасевича [9]. Более 30 лет технология изготовления ОСО мутности, применяемые методы контроля (фотометрический), используемое сырье (стекло марки Pyrex) – не менялись. В 2010-2013 гг проведена оптимизация технологии его производства (исключены некоторые стадии, заменено измерительное оборудование, расширен перечень пригодных марок сырья, введен дополнительный метод контроля) [4]. В связи с этим возникла необходимость подтвердить соответствие мутности бактериальных взвесей, приготовленных с использованием новых серий OСО, значениям общей концентрации микроорганизмов, приведенным в Инструкции по применению ОСО мутности.
Цель исследования – установить порядок применения ОСО мутности для чумного и сибиреязвенного микробов (споровая форма). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. оценить значение пересчетного коэффициента для бруцеллезного микроба, суспензия которого приготовлена в сравнении с МСО мутности ВОЗ и ОСО мутности, произведенного по усовершенствованной технологии;
2. провести исследования общей концентрации микробных клеток с использованием микробиологических методов во взвесях бактериальных культур чумного и споровой формы сибиреязвенного микробов, доведенных до 10 МЕ с применением как ОСО мутности, так и МСО мутности ВОЗ.
Материалы и методы исследования
Для исследования использовали:
- вакцина сибиреязвенная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационного нанесения /в комплекте с растворителем – глицерола раствор 30%/ (сер. 253);
- МСО мутности ВОЗ: 5 th International Reference Preparation of Opacity, 10 МЕ (5 th IRP, 76/522).
Штамм Brucella abortus 19 BА использовали как контрольный образец, для которого известен пересчетный коэффициент (1,7 млрд. м.к./мл).
Для получения I генерации вакцинного штамма B. abortus 19 BА в ампулы вносили по 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида. После растворения высевали в пробирку со скошенной питательной средой (мясопептонный агар (МПА)). Посевы инкубировали при температуре (37±1)ºС в течение 72±2 ч и хранили при температуре от 2 до 8ºС в течение 3-х мес. Вакцинный штамм B. abortus 19 BА I генерации высевали бактериологической петлей на чашки Петри с МПА. Посевы инкубировали при температуре (37±1)ºС в течение 72±2 ч (II генерация). Полученную культуру использовали для исследований.
Для получения I генерации вакцинного штамма Y. pestis ЕV чумного микроба в ампулы с лиофилизированной культурой вносили по 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида. После растворения высевали в пробирку со скошенной питательной средой (агар Хоттингера). Посевы инкубировали при температуре (27±1)ºС в течение 48±2 ч и хранили при температуре от 2 до 8ºС в течение 3-х мес. Вакцинный штамм Y. pestis ЕV I генерации высевали бактериологической петлей на чашки Петри с агаром Хоттингера. Посевы инкубировали при температуре (27±1)ºС в течение 24±2 ч (II генерация). Полученную культуру использовали для исследований.
Выросшие культуры смывали 0,9% раствором натрия хлорида. Полученные суспензии доводили до мутности 10 МЕ в соответствии с Инструкцией по применению ОСО мутности и МСО ВОЗ.
Вакцина против сибирской язвы представляет собой споровую культуру B. аnthracis, штамм СТИ-1. Подготовку взвеси для оценки концентрации спор в сибиреязвенной вакцине проводили следующим образом: вакцину ресуспендировали в соответствии с НД на препарат [7], затем доводили полученную суспензию до мутности 10 МЕ в соответствии с инструкцией по применению ОСО мутности и МСО ВОЗ (5 th IRP).
Подсчет клеток проводили в камере Горяева с помощью микроскопа Axio Scope А1 при 400-кратном увеличении (объектив 40, окуляр 10). Использование фазово-контрастного устройства позволяло исследовать суспензии неокрашенных микробных клеток.
Подсчитывали количество клеток, находящихся в 10 больших квадратах расположенных по диагонали, по 5 в каждой сетке. Осуществляли видеофиксацию изображения каждого исследуемого квадрата с помощью встроенной видеокамеры, затем проводили подсчет клеток в сделанных снимках.
Концентрацию микроорганизмов рассчитывали по формуле:
где k – разведение;
Nср = N / 10 – среднее количество клеток в одном большом квадрате;
v = 0,9 мм 3 = 0,0009 мл 3 – объем камеры;
n = 225 – количество больших квадратов в камере Горяева.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Обобщенные результаты определения общей концентрации во взвесях бруцеллезного, чумного, сибиреязвенного микробов (споровая форма), а также их статистической оценки приведены в таблице 1.
Как следует из данных, приведенных в таблице 1, значения t-критерия Стьюдента, рассчитанные по экспериментальным данным для исследуемых взвесей всех микроорганизмов (tэксп=0,23 для B. аnthracis СТИ-1; tэксп=0,34 для Y. pestis EV; tэксп=0,54 для B. abortus 19 BА), не превышают табличное t0,95;ν = 16 =2,12.
Это значит, что различие средних значений общей концентрации микробных клеток во взвесях бруцеллезного и чумного микробов, а также в сибиреязвенной вакцине, приготовленных по ОСО (серии S-5/1) и МСО ВОЗ (5 th IRP), статистически незначимо, и все полученные результаты можно использовать для установления значения соответствующих пересчетных коэффициентов.
Для B. аbortus получено значение коэффициента, равное 1,75±0,18 млрд. м.к./мл, которое практически совпадает с коэффициентом, указанным в инструкции по применению – 1,7 млрд. м.к./мл. Различие между значениями статистически не значимы, что подтверждает соответствие мутности ОСО и МСО ВОЗ (5 th IRP). Таким образом, ОСО мутности, произведенный по усовершенствованной нами технологии, обеспечивает стандартизацию бактериальных взвесей визуальным методом в соответствии с Инструкцией по применению ОСО мутности.
Далее было рассчитано итоговое значение пересчетного коэффициента для Y. pestis, как среднее арифметическое значения, полученного нами (0,91±0,12 млрд. м.к./кл) и значения, приведенного в НД на вакцину чумную – 1∙10 9 м.к./мл [1]. Итоговое значение составило – 0,95±0,24 млрд. м.к./кл (табл. 2), что незначительно отличается от значения общей концентрации для кишечной палочки (0,93 млрд. м.к./мл), приведенной в Инструкции по применению на ОСО мутности. Это согласуется с тем фактом, что размеры чумного микроба (0,5-0,8*1,0-3,0 мкм) близки к размерам кишечной палочки (0,5-0,8*1,5-3,0 мкм) [10].
Для сибиреязвенной вакцины (споровая формы B. аnthracis) итоговое значение пересчетного коэффициента рассчитали как среднее арифметическое значения, полученного нами (0,12±0,03 млрд. м.к./кл) и значения концентрации, приведенного в МУ 3.3.2.2124-06 – 0,1∙109 спор/мл [2]. Значение пересчетного коэффициента составило – 0,11±0,06 млрд. м.к./мл (табл. 2).
Результаты определения общей концентрации микробных клеток во взвесях бруцеллезного, чумного, сибиреязвенного микробов (споровая форма), приготовленных с использованием новых серий ОСО мутности и МСО ВОЗ (5 th IRP)
Читайте также: