Как сделать окраску по грамму

Обновлено: 08.07.2024

Окраска бактерий по грамму - метод дифференциальной окраски клеток прокариот, разработанный датским микробиологом Х.Грамом в 1884 году. Он заключается в последовательной обработке мазка клеток основными красителями (кристаллическим фиолетовым) и йодом с последующим отмыванием его в этаноле или ацетоне. В зависимости от свойств клеточной стенки бактерий красители могут удерживаться ими в разной степени. Бактерии, сохраняющие окраску после обработки растворителями, получили название грамположительных (Гр+), а обесцвечивающиеся - грамотрицательных (Гр-) [6].

Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, на 1--2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1--2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30--60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафранином, нейтральротом или везувином) в течение 2 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные -- в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера) [1].

В настоящее время более широкое применение в практике бактериологических исследований находит видоизмененный способ окраски Грама по Синеву.

Основной краситель в виде раствора заменяют фильтровальной бумагой, пропитанной 1%-м спиртовым раствором кристаллического фиолетового. На препарат помещают красящую бумажку и наносят на нее 2--3 капли воды. Окрашивание идет в течение 1--2 мин. Затем бумажки снимают и дальнейшую окраску препарата ведут общепринятым способом [2].

Дифференциальные методы окраски предусматривают следующие процедуры:

• Подготовленный к окраске фиксированный мазок окрашивается первично тем красителем, при помощи которого надеются выявить предполагаемый возбудитель болезни на основании его физико-химических особенностей, определяющих сродство к определенным краскам.

• Поскольку первичное окрашивание распространяется на все микроорганизмы, за ним следует протрава мазка конкретными в каждом случае химическими соединениями — кислотами, спиртом, щелочами, фенолом и пр. Результатом протравы является обесцвечивание всех находящихся в мазке микроорганизмов, кроме искомых потенциальных возбудителей предполагаемого заболевания.

• После протравы проводят вторичное дополнительное окрашивание краской контрастного цвета. Предыдущая протрава способствует прикреплению краски к обесцвеченным клеточным компонентам, и в дополнительный цвет окрашиваются практически все находящиеся в мазке микроорганизмы, за исключением возбудителя болезни.

Многие сложные дифференциально-диагностические методы окраски, как, например, окраска по Граму, определение кислотоустойчивости, зерен волютина и некоторые другие, можно рассматривать как один из первых этапов идентификации микроорганизма.

а) Дифференциальная окраска по методу Грама. В конце XIX столетия датский бактериолог Ханс Христиан Грам предложил метод дифференциальной окраски, позволивший разделить большую часть известных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на две группы — грамположительные и грамотрицательные. Спектр окрашивания по Граму включает подавляющее большинство видов бактерий, имеющих то или иное значение в патологии человека.

Исключение составляют плохо окрашивающаяся Leptospira, не окрашивающиеся Treponema, Mycoplasma, L-формы бактерий, у которых отсутствует клеточная стенка, а также очень мелкие внутриклеточные паразиты Chlamidia и Rikketsia.

Способность грамположительных клеток при окраске по Граму удерживать комплекс йода с кристаллическим фиолетовым связана, во-первых, со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с красителем, и во-вторых, со структурой пор пептидогликана, которая препятствует вымыванию красителя при обработке мазка бактерий спиртом.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий содержит 1-2 слоя пептидогликана, т.е. толщина ее намного меньше (10-20 нм), чем у грамположительных микроорганизмов. В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий также входит наружная мембрана, связанная бимолекулярным слоем липидов поверхностного слоя пептидогликана. Наружная мембрана имеет мозаичную структуру, состоящую из молекул фосфолипидов, полисахаридов и белков. Белки наружной мембраны, получившие название поринов, окружают гидрофильные поры, через которые проходят водные и другие молекулы массой до 800 Да.

Грамотрицательные бактерии при обработке препарата спиртом вследствие недостаточного количества петидогликанов в клеточной стенке утрачивают комплекс йода с кристаллическим фиолетовым, обесцвечиваются и затем приобретают контрастный цвет дополнительного красителя. Чаще всего в качестве дополнительного красителя используют фуксин или сафранин.

Со временем метод окраски по Граму стал основным методом, с которого начинается таксономическая идентификация выделенных от больного патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

При выявлении в питательных средах более или менее длинных цепочек анализ ведется в направлении выявления Streptococcus, а в челюстно-лицевых и стоматологических отделениях — Peptostreptococcus. При грамотрицательном окрашивании кокков внимание клиницистов концентрируется на выявлении и идентификации представителей рода Neisseria.

б) Общепринятый метод окраски бактерий по Граму:

• Приготовленный на предметном стекле тонкий мазок высушивают на воздухе.

• Фиксируют над пламенем горелки.

• На мазок кладут фильтровальную бумагу 2x4 см и наливают на нее раствор основного красителя — кристаллического фиолетового на 1-2 мин.

• Снимают бумагу, сливают остаток краски, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя на 1 -2 мин до почернения препарата.

• Раствор Люголя сливают, предметное стекло для обесцвечивания мазка несколько раз погружают в стаканчик со спиртом. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.

• Препарат тщательно промывают водопроводной водой.

• Докрашивают препарат водно-спиртовым раствором фуксина в течение 2 мин.

• Окрашенный мазок высушивают и микроскопируют.

Чрезвычайно важно строго соблюдать время обесцвечивания мазка, так как более продолжительная, чем предусмотрено методикой, обработка мазка спиртом ведет к обесцвечиванию грамположительных микроорганизмов, а при недостаточной по времени обработке грамотрицательных микроорганизмов они не успевают обесцветиться и сохраняют фиолетовый цвет основного красителя.

в) Упрощенный метод окраски по Граму, предложенный А. И. Синевым:

• Исследуемый мазок, высушенный и зафиксированный над пламенем горелки, покрывают полоской фильтровальной бумаги, пропитанной 1% раствором кристаллического фиолетового по Синеву. Красящую бумагу смачивают дистиллированной водой, прижимая бактериологической петлей, чтобы бумага плотно прилегала к мазку. Излишнюю воду сливают. Мазок окрашивают 2 мин, следя за тем, чтобы бумага все время оставалась влажной и плотно прилегала к мазку.

• Снимают красящую бумагу. На мазок наливают раствор Люголя и выдерживают до его почернения.

• Сливают со стекла раствор Люголя и обесцвечивают мазок 96% этиловым спиртом в течение 20-30 с.

• На обесцвеченный мазок, без предварительного промывания, кладут фильтровальную бумагу, окрашенную по Синеву фуксином Пфейфера, смачивают ее водопроводной водой и, прижав петлей к мазку, выдерживают 1 мин.

• После окраски мазок высушивают и микроскопируют.

• Препараты, изготовленные по методу Синева, отличаются четкостью и не имеют осадка.

г) Окраска микроорганизмов по Граму в модификации Хукера:

• Нанесенный на предметное стекло мазок высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.

• Погружают фиксированный мазок в склянку с основным красителем — кристаллическим фиолетовым на 1 мин.

• Окрашенный мазок промывают в слабой струе водопроводной воды в течение 2-3 с.

• Предметное стекло с мазком помещают в йодную протраву — модификацию раствора Люголя на 1 мин.

• Препарат промывают под слабой струей водопроводной воды в течение 2-3 с.

• Подсушивают препарат на воздухе или при помощи фильтровальной бумаги.

• Предметное стекло с мазком помещают в склянку с 95% (по объему) этиловым спиртом на 30 с при постоянном взбалтывании жидкости.

• После обработки этиловым спиртом мазок подсушивают фильтровальной бумагой.

• Погружают предметное стекло с обработанным мазком в склянку с дополнительным красителем — сафранином на 10 с.

• Окрашенный мазок промывают под слабой струей водопроводной воды, подсушивают и микроскопируют.

д) Окраска микроорганизмов по Граму в модификации Бёрка:

• Мазок, приготовленный для окраски, высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки.

• Предметное стекло с фиксированным мазком погружают на 2 мин в склянку с раствором кристаллического фиолетового с 2-3 каплями натрия двууглекислого.

• Окрашенный основным красителем мазок промывают йодной протравой, затем на 2 мин наслаивают на него новую протраву.

• Мазок промывают под слабой струей водопроводной воды 2 с. После промывания поверхность препарата вокруг мазка подсушивают фильтровальной бумагой, но сам мазок предохраняют от высыхания.

• Предметное стекло с мазком устанавливают в наклонном положении. На мазок по каплям наносят обесцвечивающий растворитель до тех пор, пока в струйках стекающего со стекла растворителя не исчезнет примесь краски.

• После обесцвечивания мазок подсушивают на воздухе.

• Предметное стекло с высушенным мазком опускают в склянку с дополнительным красителем — сафранином на 5-10 с.

• По окончании окраски мазок снова промывают под слабой струей водопроводной воды до исчезновения в стекающих струйках розоватого цвета.

• Высушенный на воздухе или при помощи фильтровальной бумаги мазок микроскопируют.

При использовании любого варианта окраски по Граму грамположительные бактерии окрашиваются первым красителем — кристаллическим фиолетовым, приобретая темно-фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы при обработке препарата обесцвечиваются, затем принимают цвет дополнительной контрастной краски — розовой или красной.

В отдельных случаях даже незначительные нарушения методики окрашивания или изменения, происходящие в культуре микробных клеток под влиянием различных, не всегда поддающихся учету факторов, могут дать неправильные результаты окраски по Граму. Грамположительные микроорганизмы при чрезмерном обесцвечивании препарата приобретают розово-красный цвет, характерный для грамотрицательных бактерий. Грамположительные бактерии при механическом нарушении целостности их стенок и при воздействии на них некоторых ферментов, например, лизоцима, приобретают грамотрицательную окраску. Поэтому при окрашивании микробных культур, выделенных из клинического материала, целесообразно в качестве контроля использовать заведомо известные культуры грамположительных и грамотрицательных бактерий или воспользоваться тестом Куи — Грегерсена с гидроксидом калия (КОН).

е) Окраска по Граму в модификации Калины для микроорганизмов группы нейссерий. Микроорганизмы группы нейссерий — грамотрицательны, но при окрашивании по Граму они обесцвечиваются спиртом неравномерно, это относится главным образом к гонококку. Поэтому профессор Г. П. Калина предложил специально для нейссерий щадящий метод окраски:

• На предметное стекло наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида и в ней суспендируют исследуемую культуру.

• Добавляют 1 каплю раствора бриллиантового зеленого и распределяют тонким слоем. Диаметр мазка — примерно 1 см.

• Мазок подсушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На фиксированный мазок наносят основной реактив на 1,5-2 мин.

• По окончании времени окрашивания краску сливают и предметное стекло в наклонном положении промывают сначала водопроводной водой, а затем 30% (по объему) раствором этанола до отхождения облачка краски и снова промывают водой.

• Промытый препарат докрашивают водным раствором фуксина в течение 2 мин.

• Мазок окончательно промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Грамположительные бактерии приобретают зелено-черный или фиолетовый цвет, грамотрицатсльные — ярко-розовый. Желательно для контроля на отдельном стекле окрашивать мазки культур стафилококка и кишечной палочки.

ж) Тест Куи — Грегерсена с КОН для уточнения сомнительных результатов окраски по Граму. Обычно оценка результатов окраски по Граму не представляет трудностей. Однако в отдельных случаях грамположительные микроорганизмы, например, спороносные палочки, приобретают грамотрицательную окраску, тогда как некоторые штаммы грамотрицательных бактерий родов Acinetobacter и Moraxella имеют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, вследствие чего выглядят как грамположительные. Для уточнения таких сомнительных результатов японский ученый Е. Куи в 1938 г. предложил КОН-тест (тест Грегерсена). В основе этого теста лежит способность клеточных стенок грамположительных бактерий, в отличие от грамотрицательных, сохранять целостность при воздействии на них гидроксида калия (КОН).

Для постановки этого теста петлю суточной агаровой культуры испытуемого штамма суспендируют на предметном стекле в капле 3% раствора КОН. При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, через несколько секунд жидкость в капле приобретает слизистую консистенцию, и при отрыве от предметного стекла слизистые нити тянутся на 0,5-2 см. Учет результатов пробы рекомендуется проводить на темном фоне.

Приобретение грамотрицательными бактериями слизистой консистенции при обработке их гидроксидом калия связывают с выходом из клеток ДНК, представляющей собой вязкий компонент.

Окраска по Граму (или метод Грама) — эмпирически выведенный метод различения бактерий с помощью окрашивания их определенным методом на две большие группы: Грамположительные и Грамотрицательные), различающихся химическими и физическими свойствами их клеточной стенки.

Этимология

Метод называется в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Христиана Грама (1853-1938), который разработал этот метод в 1884 году чтобы различить бактерии Pneumococcus и Klebsiella pneumoniae.

Использование

Окраска по Граму — одна из самых полезных красящих процедур в лабораторных исследованиях в микробиологии. Процедура широко используется как инструмент для различения Грамм-отрицательных и Грам-положительных бактерий, обычно являются первым шагом в определении идентичности специфического бактериального образца.

В медицине окрашивания по Граму выполняется при анализе крови или биопсии, когда подозревается инфекция. Этот метод гораздо быстрее, чем культура, и особенно важен, когда определение типа инфекции необходимо для прогноза и выбора метода лечения. Например, при диагностике цереброспинальной жидкости менингитом и жидкости суставов на септический артрит.

При анализе, например, Коки и спороносные формы бактерий, а также дрожжи — грам-положительные и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, большинство других бактерий — грамотрицательные и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток эукариот приобретают ярко красного цвета, а цитоплазма — розового.

Техника проведения окрашивания

Окраска по Граму относится к сложному способу окрашивания, когда на мазок влияют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обезбарвлюючи вещества: спирт, кислоты и др. Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметанового группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристалл виолет. Грам-положительные (грамм (+)) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительном окраске фуксином Грамм (+) микроорганизмы не меняют сначала присоединен фиолетовый цвет.

Грамотрицательные (грамм (-)) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом соединения, легко разрушается под действием спирта. В результате микробы обесцвечиваются и потом окрашиваются фуксином, приобретая красного цвета.

Подготовка материала для окраски

Материал исследуемого распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация

При фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла, и поэтому при дальнейшем окрашивании препарата клетки не смываются. Кроме того, убиты микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положена действие высокой температуры на клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации Стекло с препаратом берут пинцетом и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют таким приемом: свободную от мазка поверхность стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильной фиксации стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущение ожога (70-80 ° С).

Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96% и наркозного эфира в соотношении 1: 1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96% — 60%, хлороформа 30%, ледяной уксусной кислоты 10 %). Стекло с высушенным мазком погружают в стакан с фиксирующей веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

В статье автор описывает принцип окрашивания бактерий методам Грама, разбирается в причинах выделения грамположительных и грамотрицательных видов и в клинической важности окрашивания бактерий.

Ключевые слова: бактерии, грамположительные и грамотрицательные, окрашивание, резистентность, антибиотики

Бактерии широко распространены на нашей планете, как в окружающей среде, так и внутри тела человека. Многие из них чрезвычайно полезны и нашли свое применение во многих отраслях: фармакологии, медицине, пищевой промышленности. Однако стоит выделить две группы: патогенные и условно патогенные бактерии. Их особенность состоит в том, что они являются возбудителями инфекционных и воспалительных процессов [2].

Особый вклад в изучение этих групп бактерий внес Ганс Христиан Грамм — микробиолог из Дании, открывший метод окрашивания бактерий, применимый и в наше время. Согласно данному методу препарат необходимо зафиксировать — чаще всего это делается при помощи высокой температуры, однако есть и другие методы. Поскольку бактерии дают слабощелочную среду, зафиксированный препарат окрашивают основными красителями трифенилметановой группы, например, генцианвиолет, метилвиолет, кристаллвиолет. Для закрепления краски на поверхности бактерий применяется протравка — йод (часто применяют раствор Люголя), пикриновая кислота. На части бактерий краска прочно фиксируется и не обесцвечивается нейтральным спиртом или ацетоном, такие бактерии называются грамположительными. В другой группе краситель полностью обесцветится — это грамотрицательные бактерии. Для окрашивания этого типа бактерий необходимо применение специальной контрастной краски. Причин этого явления выделяют несколько. Первая — наличие у грамположительных бактерий ненасыщенных жирных кислот, которые могут связываться с йодом, что делает клеточную стенку непроницаемой для нейтрального спирта и последней не может проникнуть в клетку и обесцветить краситель в ней.

Другие авторы выделяют в качестве причины разность в кислотно-основных свойствах протоплазмы, считая, что изоэлектрическая точка грамотрицательных бактерий более смещена в щелочную среду. Если учесть, что йод в составе протравы является окислителем и смещает pH бактерий в кислую сторону. Из этого можно сделать вывод, что грамположительные бактерии будут проявлять более сильные кислотные свойства, то химические различия с грамотрицательными бактериями явны. Кроме того, можно подчеркнуть, что снижение изоэлектрической точки позволяет усилить связь с красителем у грамположительного штамма.

Согласно химической теории, разность в окрашивании обусловлена наличием на клеточной стенке грамположительных бактерий комплекса белка с рибонуклеатом магния. Опытным путем доказано, что после удаления данного комплекса с поверхности грамположительной бактерии, повторное окрашивание показывает бактерию как грамотрицательную.

Другой причиной неодинаковой окраски является различие в клеточной стенке, ее толщине и проницаемости. У грамположительных бактерий она достаточно широкая, что способствует более глубокому проникновению в нее красителя, благодаря чему последний не поддается обесцвечиванию нейтральным спиртом. Важным является и содержание пептидогликанов — у этого типа оно велико. Необходимо учитывать и разность структуры пептидогликанов у грамположительной и грамотрицательной групп. Первая группа окрашивается в фиолетовый цвет и считается патогенной.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий более тонкая, чем у грамположительных бактерий, поэтому при промывании после окрашивания спирт обесцвечивает краситель, и характерная окраска исчезает. К грамотрицательным бактериям относят условно патогенные формы.

Разработанный Грамом метод применяется и в современной медицине. Бактериоскопия — метод визуального анализа биологического материала под микроскопом [4]. Процедура достаточно проста и позволяет определить бактериальное заражение и принадлежность бактерий к грамположительным или грамотрицательным.

Определение грамположительности и грамотрицательности является очень важным, поскольку позволяет определить восприимчивость исследуемого вида к антибиотикам, что, безусловно, влияет на назначения врача. Устойчивость связана с тонкостью, прочностью и низкой проницаемостью клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Эта особенность позволяет значительно снижать концентрацию антибиотика в пределах клетки бактерии. В связи с этим антибиотик не может воздействовать ни на структуры клетки-мишени, ни на ее ферментные реакции, ни на реакции синтеза [1].

Окраска по Граму позволяет не только определить резистентность к антибиотику, но и видовую принадлежность бактерии, что определяет диагноз пациента, а значит особенности лечения и подбора лекарственных препаратов. Все это, безусловно, важно в клинической практике.

К грамположительным относятся кокки, вибрионы, палочки, бациллы, корниебактерии, микобактерии, бифидобактерии и актиномицеты. (Таблица 1). Стрептококки и стафилококки провоцируют грибковые инфекции и вызывают фарингит, пневмонию, сепсис, синусит, отит, кроме того поражают мочевыводящие пути, сердце провоцируют нагноения ран. К данной группе также относятся возбудители газовой гангрены, туберкулеза, сибирской язвы, дифтерии, ботулизма, столбнячной инфекции и других.

К грамотрицательным относятся кокки, палочки, вибрионы, спириллы, спирохеты и др. (Таблица 1). Они окрашиваются сафранином в розово-красный цвет. Представители данного типа являются возбудителями таких гнойно-воспалительных заболеваний, как бруцеллез, хламидиоз, туляремия, чума, бактериальный менингит, язвенную болезнь желудка и другие нарушения желудочно-кишечного тракта, гонорею, сифилис и многие другие [3].

Грамположительные играмотрицательные формы бактерий

Таким образом, бактерии играют важную роль в жизни человека, не только участвуя в производственных процессах, но и вызывая заболевания. Болезнетворные бактерии принято подразделять на патогенные и условно патогенные (приводящие к болезни при ослаблении иммунитета или резких негативных изменениях условий обитания). По способности к окрашиванию бактерии подразделяются на грамположительные и грамотрицательные. Существует несколько причин, по которым вторая группа поддается осветлению нейтральными спиртами. Окрашивание бактерий является важным аналитическим признаком, позволяющем определить видовую принадлежность микроорганизма и его устойчивость к отдельным видам антибиотиков.

Caldwell R.,Lindberg D.: Understanding Evolution. University of California Museum of Paleontology (2011).
Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология: Учебник. — 2003. − 464 с.
Пиневич А. В. Микробиология. Биология прокариотов: в 3 т. — СПб.: Издательство С.-Петербургского университета, 2006. — ISBN 5–288–04056–7.
Суворов А. Л. Микроскопия в науке и технике / Отв. ред. д-р физ.-мат. наук В. Н. Рожанский; Академия наук СССР. — М.: Наука, 1981. — 136, [1] с. — (Наука и технический прогресс).

Основные термины (генерируются автоматически): бактерия, клеточная стенка, нейтральный спирт, группа, краситель.

Окраска по Граму смешанной Золотистый стафилококк (S. aureus ATCC 25923, Грамположительный кокки, фиолетовый) и кишечная палочка (Кишечная палочка ATCC 11775, грамотрицательный бациллы, красный цвет), наиболее распространенные эталонные бактерии, окрашенные по Граму

Окраска по Граму или же Окрашивание по Граму, также называемый Метод Грама, это метод окрашивание используется для различения и классификации бактериальный виды на две большие группы: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии. Название происходит от датского бактериолог Ганс Кристиан Грам, кто разработал методику. [1]

Окрашивание по Граму позволяет дифференцировать бактерии по химическим и физическим свойствам клеточные стенки. Грамположительные клетки имеют толстый слой пептидогликан в клеточной стенке, которая сохраняет первичное пятно, кристально-фиолетовый. Грамотрицательные клетки имеют более тонкий слой пептидогликана, который позволяет кристаллическому фиолетовому вымываться при добавлении этанола. Они окрашены в розовый или красный цвет контрастировать, [2] обычно сафранин или же фуксин. Йод Люголя раствор всегда добавляется после добавления кристаллического фиолетового, чтобы усилить связь пятна с клеточной мембраной. Окрашивание по Граму почти всегда является первым этапом предварительной идентификации бактериального организма. Хотя окрашивание по Граму является ценным диагностическим инструментом как в клинических, так и в исследовательских целях, не все бактерии могут быть окончательно классифицированы с помощью этого метода. Это дает начало группам с граммовой переменной и грамм-неопределенным.

Содержание

История

Метод назван в честь своего изобретателя Датский ученый Ганс Кристиан Грам (1853–1938), которые разработали эту технику, работая с Карл Фридлендер в морге городской больницы в г. Берлин в 1884 г. Грам разработал свою технику не для того, чтобы отличить один тип бактерий от другого, а для того, чтобы сделать бактерии более заметными на окрашенных срезах легочной ткани. [3] Он опубликовал свой метод в 1884 году и включил в свой краткий отчет наблюдение, что тиф бацилла пятно не осталось. [4]

Использует

Окрашивание по Граму - это бактериологический лаборатория техника [5] используется для различения бактериальный виды на две большие группы (грамположительный и грамотрицательный) на основе физических свойств их клеточные стенки. [6] [ страница нужна ] Окрашивание по Граму не используется для классификации археи, ранее архебактерии, так как эти микроорганизмы дают сильно различающиеся ответы, которые не следуют их филогенетические группы. [7]

Некоторые организмы являются грамм-переменными (это означает, что они могут окрашивать либо отрицательно, либо положительно); некоторые из них не окрашены ни одним из красителей, используемых в технике Грама, и не видны. В современной лаборатории экологической или молекулярной микробиологии большая часть идентификации выполняется с использованием генетических последовательностей и других молекулярных методов, которые гораздо более специфичны и информативны, чем дифференциальное окрашивание.

Было высказано предположение, что окрашивание по Граму является столь же эффективным диагностическим инструментом, как и ПЦР в одном первичном исследовательском отчете относительно гонорея. [8] [ неосновной источник необходим ]

Медицинское

Окрашивание по Граму выполняется на жидкость тела или же биопсия когда инфекционное заболевание подозревается. Окрашивание по Граму дает результаты намного быстрее, чем культивирование, и особенно важны, когда инфекция может иметь важное значение для лечения пациента и прогноза; примеры спинномозговая жидкость за менингит и синовиальная жидкость за септический артрит. [5] [9]

Механизм окрашивания

Окрашенные в фиолетовый цвет грамположительные (слева) и грамотрицательные с розовой окраской (справа)

Грамположительные бактерии имеют толстую сетчатую клеточную стенку, состоящую из пептидогликан (50–90% клеточной оболочки), и в результате окрашиваются в пурпурный кристаллическим фиолетовым, тогда как грамотрицательные бактерии имеют более тонкий слой (10% клеточной оболочки), поэтому не задерживают пурпурное пятно и не окрашиваются розовый от сафранина. Есть четыре основных этапа окрашивания по Граму:

Нанесение основного красителя (кристально-фиолетовый) на термофиксированный мазок бактериальной культуры. Тепловая фиксация убивает некоторые бактерии, но в основном используется для прикрепления бактерий к предметному стеклу, чтобы они не смывались во время процедуры окрашивания.
Добавление йодид, который связывается с кристаллическим фиолетовым и удерживает его в клетке
Быстрое обесцвечивание этиловый спирт или же ацетон с сафранин. [10]Карбол фуксин иногда заменяется сафранином, поскольку он более интенсивно окрашивает анаэробные бактерии, но в качестве контрастного красителя он используется реже. [11]

Кристально-фиолетовый (CV) в водных растворах диссоциирует на резюме +
и хлорид ( Cl −
) ионы. Эти ионы проникают через клеточную стенку как грамположительных, так и грамотрицательных клеток. В резюме +
ion взаимодействует с отрицательно заряженными компонентами бактериальных клеток и окрашивает клетки в фиолетовый цвет. [12]

Йодид ( я −
или же я −
₃ ) взаимодействует с резюме +
и образует большие комплексы кристаллического фиолетового и йода (CV – I) внутри внутреннего и внешнего слоев клетки. Йод часто называют едкий, но является захватывающим агентом, который предотвращает удаление комплекса CV – I и, следовательно, окрашивает клетку. [13]

Когда добавляется обесцвечивающее средство, такое как спирт или ацетон, оно взаимодействует с липидами клеточной мембраны. [14] Грамотрицательная клетка теряет свою внешнюю липополисахаридную мембрану, а внутренний пептидогликановый слой остается открытым. Комплексы CV – I вымываются из грамотрицательной клетки вместе с внешней мембраной. [15] Напротив, грамположительные клетки обезвоживаются в результате обработки этанолом. Большие комплексы CV – I оказываются захваченными грамположительной клеткой из-за многослойной природы ее пептидогликана. [15] Этап обесцвечивания имеет решающее значение и должен быть правильно рассчитан; окраска кристаллического фиолетового удаляется как с грамположительных, так и с отрицательных клеток, если обесцвечивающий агент остается на слишком долгое время (в течение нескольких секунд). [16]

После обесцвечивания грамположительные клетки остаются пурпурными, а грамотрицательные клетки теряют пурпурный цвет. [16] Контркрашивание, которое обычно представляет собой положительно заряженный сафранин или основной фуксин, наносится последним, чтобы придать обесцвеченным грамотрицательным бактериям розовый или красный цвет. [2] [17] И грамположительные бактерии, и грамотрицательные бактерии улавливают контрастное пятно. Однако контрастное окрашивание не видно на грамположительных бактериях из-за более темного кристаллического фиолетового пятна.

Примеры

Грамположительные бактерии

Грамположительные бактерии обычно имеют единственную мембрану (монодерма) в окружении толстого пептидогликана. Этому правилу следуют два типа: Фирмикуты (кроме классов Молликуты и Negativicutes) и Актинобактерии. [6] [18] Напротив, члены Хлорофлекси (зеленые несернистые бактерии) являются монодермами, но обладают тонким или отсутствующим (класс Dehalococcoidetes) пептидогликан и может окрашивать отрицательно, положительно или неопределенно; члены Дейнококк – Термус группа окрашивание положительное, но представляет собой дидерман с толстым пептидогликаном. [6] [ страница нужна ] [18]

Исторически, грамположительные формы составляли филюм Фирмикуты, имя, которое теперь используется для самой большой группы. Он включает в себя многие известные роды, такие как Lactobacillus, Bacillus, Листерия, Стафилококк, Стрептококк, Энтерококк, и Clostridium. [19] Он также был расширен за счет включения молликутов, бактерий, таких как Микоплазма и термоплазма которые лишены клеточных стенок и поэтому не могут быть окрашены по Граму, но происходят из таких форм. [20]

У некоторых бактерий есть клеточные стенки, которые особенно хорошо удерживают пятна. Они будут казаться положительными при окрашивании по Граму, даже если они не имеют близкого родства с другими грамположительными бактериями. Они называются кислотоустойчивые бактерии, и отличить их от других грамположительных бактерий можно только специальные процедуры окрашивания. [21]

Грамотрицательные бактерии

Грамотрицательные бактерии обычно обладают тонким слоем пептидогликана между двумя мембранами (diderms). Наиболее бактериальный тип грамотрицательные, в том числе цианобактерии, зеленые серные бактерии, и большинство Протеобактерии (за исключением некоторых членов Риккетсиалес и насекомые-эндосимбионты Энтеробактерии). [6] [ страница нужна ] [18]

Грамотрицательные и грамотрицательные бактерии

Некоторые бактерии после окрашивания красителем по Граму дают картину с грамм-переменной: видна смесь розовых и пурпурных клеток. [15] [22] В культурах Бациллы, Butyrivibrio, и Clostridiumуменьшение толщины пептидогликана во время роста совпадает с увеличением количества клеток, окрашивающих грамотрицательные. [22] Кроме того, у всех бактерий, окрашенных с помощью окрашивания по Граму, возраст культуры может влиять на результаты окрашивания. [22]

Грамотрицательные бактерии не реагируют предсказуемо на окрашивание по Граму и, следовательно, не могут быть определены как грамположительные или грамотрицательные. Примеры включают множество видов Микобактерии, включая Mycobacterium bovis, Mycobactrium leprae и Микобактерии туберкулеза, последние два из которых являются возбудителями проказы и туберкулеза соответственно. [23] [24]

Орфографическое примечание

Период, термин Окрашивание по Граму происходит от фамилии Ганс Кристиан Грам; в эпоним Следовательно, (Грамм) пишется с заглавной буквы, а не нарицательное существительное (пятно), как это принято в научных терминах. [25] Начальные буквы грамположительный и грамотрицательный, которые одноименные прилагательные, может быть заглавной грамм или строчные граммв зависимости от того, что гид по стилю (если есть) управляет написанием документа. Строчные буквы используются в США. Центры по контролю и профилактике заболеваний и другие режимы стиля, такие как AMA стиль. [26] Словари могут использовать строчные буквы, [27] [28] верхний регистр, [29] [30] [31] [32] или оба. [33] [34] Верхний регистр Грамположительный или же Грамотрицательный использование также распространено во многих научный журнал статьи и публикации. [34] [35] [36] Когда статьи отправляются в журналы, каждый журнал может применять или не применять собственный стиль к постпринт версия. Препринт версии содержат тот стиль, который использовал автор. Даже режимы стиля, в которых прилагательные используются в нижнем регистре грамположительный и грамотрицательный по-прежнему обычно используют капитал для Окраска по Граму.

Читайте также: