Как сделать прокаленную кость
Обновлено: 07.07.2024
Оборудование и материалы: Натуральная, прокаленная ,декальцинированная кости животных.
Лабораторная работа №4.Строение и функций суставов.
Цель: Определите значение суставов, взаимосвязь строения и функций.
Оборудование и материалы: Модель скелета человека, рисунки учебника.
Рассмотрите на рисунках учебника и на модели скелета человека плечевой и локтевой суставы.
Установите,какими костями они образованы.
Выясните на себе, какие движения возможно совершать в плечевом и локтевом суставах.
1. Рассматриваем при малом увеличении микроскопа костную ткань. С помощью рисунка 23, А и Б определяем, поперечный или продольный срез мы рассматриваем.
2. Находим канальцы, по которым проходили сосуды и нервы. На поперечном срезе они имеют вид прозрачного кружка или овала. На продольном срезе – вид продолговатых полых образований внутри кости, которые тянутся внутрь нее, разветвляются и постепенно становятся тонкими.
3. Находим костные клетки, которые находится между кольцами, и имеют вид черных паучков. Они выделяют пластинки костного вещества, которые потом пропитываются минеральными солями.
4. Вывод:
Мы рассмотрели при малом увеличении микроскопа костную ткань. На рисунке 23 А мы увидели продольный срез. На рисунке 23 Б – поперечный срез. Канальцев, по которым проходили сосуды и нервы, больше содержится в губчатом веществе кости. Однако и в компактном они также есть. Костными клетками заполнено почти все видимое пространство на обеих картинках.
Можно сделать вывод, что строение компактного вещества в кости обусловлено тем, что в нем пролегают нервы и сосуды, которые питают эту кость. Такое строение обеспечивает за счет полости трубочек наименьшую плотность, но высокую прочность, так как эти трубочки имеют малый вес, высокую прочность и ветвистую структуру. Последний аспект обеспечивает максимальную прочность, ведь осевая нагрузка распределяется не в одном направлении, а постепенно уменьшается. Именно по такому типу изготавливают и корпуса самолетов. Для них используют прочные дюралюминиевые конструкции, а не листовой прокат.
Лабораторная работа. Утомление при статической работе
Стр. 94
Оборудование: секундомер, груз 4 – 5 кг (если взят портфель с книгами, то надо предварительно определить его массу).
Наблюдение признаков утомления при статической работе. Выясните, за какое время наступает предельное утомление.
Ход работы:
Становимся лицом к классу, вытягиваем руку в сторону строго горизонтально. Мелом на доске отмечаем тот уровень, на котором находится рука.
После приготовлений по команде включаем секундомер, и начинаем удерживать груз на уровне отметки.
Начальное время указываем в первой строчке таблицы. Затем определяем фазы утомления и проставляем их время.
Выясняем, за какое время наступает предельное утомление. Записываем показатели в таблицу.
| Статическая работа | Признак утомления | Время |
|---|---|---|
| Отсутствие утомления | Рука с грузом неподвижна | 3 минуты |
| Первая фаза утомления | Рука немного опускается, а потом рывком поднимается в исходное положение | 8 минут |
| Вторая фаза утомления | Дрожь в руке, пошатывание корпуса тела, повышение потоотделения, потеря координации | 13 минут |
| Предельное утомление | Рука с грузом опущена, опыт завершен | 16 минут |
Вывод: мы наблюдали за появлением признаков утомления при статической работе, определяли время наступления первой и второй фаз утомления, а также предельного утомления. Статическая работа подразумевает испытание выносливости тела человека, ведь оно находится определенное время в одном положении.
Лабораторная работа. Осанка и плоскостопие
Стр. 98
1. Выявление нарушений осанки
Оборудование: сантиметровая лента.
Ход работы:
1. Для выявления сутулости (круглой спины) сантиметровой лентой было измерено расстояние между самыми отдаленными точками левого и правого плеча, а после, отступя на 3 – 5 см вниз от плечевого сустава, со стороны груди и со стороны спины. Первый результат – 63 см разделили на второй – 61 см:
Вывод: нарушений нет.
2.Была выполнена требуемая поза – встать спиной к стенке так, чтобы пятки, колени, таз и лопатки касались стены. Попытка просунуть между спиной и стеной кулак не удалась. Попытка просунуть между спиной и стеной ладонь – удалась.
Вывод: нарушений осанки не выявлено.
2.Выявление плоскостопия
Оборудование: таз с водой, лист бумаги, фломастер или простой карандаш.
Ход работы:
После проведения манипуляций, указанных в задании, было выяснено, что в узкой части отпечатка стопы нет выпадов за пределы линии.
Вывод: плоскостопия нет.
Лабораторная работа. Изучение особенностей кровообращения
Стр. 138
I. Функция венозных клапанов
Предварительные пояснения.
Если рука опущена, венозные клапаны не дают крови стечь вниз. Клапаны раскрываются лишь после того, как в ниже лежащих сегментах накопится достаточное количество крови, чтобы открыть венозный клапан и пропустить кровь вверх, в следующий сегмент. Поэтому вены, по которым кровь движется против силы тяжести, всегда набухшие.
Ход опыта:
Я поднимаю одну руку вверх, а вторую опускаю вниз. Спустя минуту кладу обе руки на стол.
Ответы на вопросы:
№ 1. Почему поднятая рука побледнела, а опущенная – покраснела?
Рука, которая была опущена вниз, стала красной, потому что вены в ней наполнились кровью. Такое явление происходит из-за того, что сердце вынуждено преодолевать силу тяжести руки.
Рука, которая была поднята вверх, побелела, так как действие силы тяжести на нее совпало с направлением движения крови, которая не застаивается и не давит на стенки вен и капилляров.
№ 2. В поднятой или опущенной руке клапаны вен были закрыты?
Клапаны закрыты были в опущенной руке, потому что кровь поднимается вверх по руке по венам, а возвращается по венам большого круга к сердцу. Клапаны служат своеобразной преградой и дают крови стекать обратно, тем самым способствуя ее движению в едином направлении.
Вывод:
Опустив руку вниз, я увидел, что она стала красной. Так произошло, потому что сердцу приходится преодолевать дополнительно силу тяжести руки. Плюс, кровь в венах застаивается, а давление на ее стенки становится сильнее.
Рука, которая была поднята вверх, стала бледной. Такое явление поясняется тем, что ее сила тяжести совпадает с направлением движения крови, которая не застаивается и не давит на стенки капилляров и вен.
Когда я положил обе руки на стол, они стали находится немного выше уровня сердца. Это способствовало тому, что стенки сосудов уменьшились, давление снизилось, обе руки приобрели здоровый естественный вид.
II. Изменения в тканях при перетяжках, затрудняющих кровообращение (рис. 64).
Оборудование: аптечное резиновое кольцо или нитки.
Ход опыта:
Я перетягиваю палец с помощью нитки и провожу наблюдения за изменением цвета кожи и другими изменениями. Палец становится набухшим, красным, на ощупь плотным, появляется болезненность. Так происходит из-за того, что нить затрудняет отток крови по венам, а лимфы – по лимфатическим узлам. Если дольше держать палец перетянутым, он может посинеть, так как такая перетяжка не перекрывает полностью приток крови к пальцу, однако полностью прекращает отток крови обратно к сердцу.
Дотрагиваюсь перетянутым пальцем до какого-либо предмета. Наблюдаю за ответной реакцией своего пальца – ощущение щекотки, легкого покалывания. Так объясняется кислородное голодание тканей пальца.
После этого я снимаю перетяжку ниткой и массирую палец по направлению к сердцу. Движение крови по капиллярам восстанавливается, состояние кожи пальца становится прежним.
Ответы на вопросы:
№ 1. Почему вредно туго затягиваться ремнем, носить тесную обувь?
Потому что это не только доставляет дискомфорт и неудобство, но и препятствует нормальному кровоснабжению сдавленных органов, тканей. А это чревато кислородным голоданием и даже отмиранием.
№ 2. Почему вышли из моды корсеты, которые затягивались дамы XIX столетия?
Корсеты – это уникальные приспособления, которые носили девушки тех веков, дабы придать своей фигуре стройности и подтянутости. Однако они сильно перетягивали грудную и брюшную полости, из-за чего в них нельзя было нормально дышать, двигаться и долгое время находиться.
Вывод:
Если сильно затянуть палец ниткой, то отток крови нарушается. Возникает дискомфорт, покраснение кожи, болевые ощущения. Длительное нахождение пальца в таком состоянии чревато кислородным голоданием и, как следствие, отмиранием ткани. После того, как нить с пальца была снята, кровоснабжение в нем восстановилось, а кожа приобрела прежний вид.
Лабораторная работа. Функциональная проба. Реакция сердечно-сосудистой системы на дозированную нагрузку
Стр. 157
Оборудование: секундомер или часы с секундной стрелкой.
Предварительные пояснения:
Цель этой работы - познакомиться с функциональными пробами, позволяющими выяснить степень тренированности своего сердца. Для этого измеряют частоту сердечных сокращений (ЧСС) в состоянии покоя и после дозированной нагрузки. На большом статистическом материале выяснено, что у здоровых подростков (после 20 приседаний) ЧСС возрастает на 1/3 по сравнению с состоянием покоя и нормализуется спустя 2-3 минуты после окончания работы. Зная эти данные, можно проверить состояние своей сердечно-сосудистой системы.
Ход опыта:
1. Измеряем пульс в состоянии покоя. Для этого делаем 3-4 измерения за
10 секунд, и среднее значение умножаем на 6.
2. Делаем 20 приседаний в быстром темпе, садимся и тут же измеряем ЧСС за 10 секунд.
3. Повторяем замеры через каждые 20 секунд. Определяем ЧСС за 10 секунд. (При замерах 20 секунд отсчитываем от конца предшествующего измерения).
4. Результаты оформляем в таблице:
Вывод: после проведения опыта я могу сказать, что после физической нагрузки на мой организм ЧСС повысилась за счет увеличения частоты сердечных сокращений. Мои результаты замеров ЧСС после приседаний повысились почти в два раза. Это средний результат. Спустя 10, 20 и 30 минут после завершения приседаний я наблюдал, что пульс нормализовался.
Лабораторная работа. Действие слюны на крахмал
Стр. 211
Оборудование: накрахмаленный бинт, нарезанный на куски длиной 10 см, вата, спички, блюдце, раствор йода (5%-ы), вода.
Предварительные пояснения. Цель этого опыта – показать, что ферменты слюны способны расщеплять крахмал. Известно, что крахмал с йодом дает интенсивное синее окрашивание, по которому нетрудно узнать, где крахмал сохранился. При обработке крахмала ферментами слюны он разрушается, если ферменты активны. В этих местах крахмала не остается, поэтому они не откраиваются йодом и остаются светлыми.
Ход работы:
Готовим реактив на крахмал – йодную воду. Добавляем несколько капель йода в воду до получения жидкости цвета крепкого заваренного чая.
Наматываем на спичку вату, смачивая ее слюной. Далее пишем ватой букву на накрахмаленном бинте.
Расправленный бинт зажимаем в руках и держим его некоторое время, чтобы он нагрелся (1-2 минуты).
Опускаем бинт в йодную воду, тщательно расправив его. Участки, где остался крахмал, окрашиваются в синий цвет, а места, обработанные слюной, останутся белыми, так как крахмал в них распался до глюкозы, которая под действием йода не дает синего окрашивания. На синем фоне получилась белая буква.
Ответы на вопросы:
Субстратом является крахмал, а ферментом будет амилаза в составе слюны.
Синяя буква на белом фоне при проведении опыта не получится.
При кипячении слюны ферменты, которые входят в её состав, будут разрушаться. Соответственно, на крахмал слюна, которая продет процесс кипячения, действовать не будет.
Вывод: по итогу проведения опыта мы смогли увидеть, что при воздействии йода крахмал окрашивается в темно-синий цвет. Исключение составляет место, где была нанесена слюна.
Также мы видим, что на крахмале, который обработан слюной, окрашивания не произошло. Это значит, что слюна способствовала расщеплению крахмала.
Лабораторная работа. Установление зависимости между нагрузкой и уровнем энергетического обмена по результатам функциональной пробы с задержкой дыхания до и после нагрузки
Стр. 245
Оборудование: секундомер или часы с секундной стрелкой.
Ход работы:
В положении сидя задерживаем дыхание при вдохе на максимальный срок. Включаем секундомер (предварительное глубокое дыхание перед опытом не допускается!). Мой результат – 37 секунд.
Выключаем секундомер в момент восстановления дыхания. Записываем результат. Отдыхаем 5 мин.
Встаем и делаем 20 приседаний за 30 секунд.
Вдыхаем, быстро задерживаем дыхание и включаем секундомер, не дожидаясь, пока дыхание успокоится, садимся на стул.
Выключаем секундомер при восстановлении дыхания. Записываем результат. Вычисления делаю следующим образом: (15*10)/37 = 40,05% или округляем 40,1%.
Спустя минуту повторяем первую пробу. Результат записываем. В этот раз результат составляет 42 секунды, что в процентном соотношении будет равно: (37*100)/42 = 88,09% или округляем 88,1%.
Ответы на вопросы:
№ 1. Почему при задержке дыхания в крови накапливается углекислый газ?
Потому что при дыхании выделяется углекислый газ. Если будет задержка дыхания, то углекислый газ не сможет выделяться из организма, а будет накапливаться там.
№ 2. Почему при определенной концентрации углекислого газа в крови дыхание восстанавливается непроизвольно?
Дыханием управляет дыхательный центр в продолговатом мозге. Он получает импульсы, которые информируют о насыщенности крови кислородом и углекислым газом. Когда мозг понимает, что концентрация углекислого газа повышается, он задает команду дышать. Соответственно, человек не может контролировать данный процесс по своему желанию.
№ 3. Как углекислый газ воздействует на дыхательный центр?
№ 4. Почему эти воздействия называются гуморальными?
Потому что эти воздействия связаны с взаимодействием химических молекул, а не нервных импульсов.
№ 5. Почему после работы удается задержать дыхание на меньшее время, чем в состоянии покоя?
Потому что организм терпит физические нагрузки, при которых сердце бьётся быстрее, а значит, и кровь бежит быстрее. Из-за этого организму требуется больше кислорода.
№ 6. Почему у тренированного человека энергетический обмен происходит более экономно, чем у человека нетренированного?
Общий расход энергии у тренированного человека будет почти на 10-15% ниже, чем у нетренированного. Понижение таких затрат связано с улучшением вентиляции легких, уменьшением количество потребляемого кислорода. Натренированный человек может лучше расслаблять и напрягать свои мышцы. Для нетренированного человека такие манипуляции связаны с дополнительными затратами энергии.
Лабораторная работа. Выработка навыка зеркального письма как пример разрушения старого и образования нового динамического стереотипа
Стр. 342
Условия работы:
Опыт можно проводить одному, но лучше, если он проводится в присутствии других людей. Тогда более отчетливо проявляются эмоциональные компоненты, связанные с перестройкой динамического стереотипа.
Ход работы:
С правой стороны ставим затраченное время.
Предлагаем испытуемому написать то же слово зеркальным шрифтом: справа налево. Писать надо так, чтобы все элементы букв были повернуты в противоположную сторону. Делаем 10 попыток, около каждой из них с правой стороны ставим время в секундах.
Оформление результатов:
Строим график. На оси X (абсциссе) отмечаем порядковый номер попытки, на оси У (ординате) — время, которое было потрачено на написание очередного слова.
Считаем, сколько разрывов между буквами было при написании слова обычным способом, сколько разрывов стало при первой и последующих попытках написания слова справа налево. Отметьте, в каких случаях возникают эмоциональные реакции: смех, жестикуляция, попытка бросить работу и др. Называем число букв, в которых встречаются элементы, написанные старым способом.
| Время на написание слова, с. | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Обычным способом | Способом зеркального письма | |||||||||
| 6 | Попытки | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 42 | 40 | 39,5 | 38 | 37,5 | 36,2 | 36 | 35 | 33 | 30 | |
Ответы:
№ 1. Какие факты говорят, что при разрушении динамического стереотипа происходит распад общей деятельности на отдельные элементы, например слово, написанное ранее одним росчерком, выписывается теперь по буквам?
При написании слова новым росчерком происходит обдумывание движений по выведению той или иной буквы.
№ 2. Делаются ли при формировании нового динамического стереотипа попытки соединять буквы без дополнительной инструкции? Нужны ли эти инструкции для овладения приемами рационального письма?
Да, такие попытки делаются, происходит формирование нового динамического стереотипа, а потому все действия выполняются без инструкции.
При написании слова в зеркальном отражении старый стереотип держится долго, но потом он уступает место новому – происходит повторение одного и того же раздражителя. В результате образуется новый навык, который продолжает конкурировать со старым.
Лабораторная работа. Измерение числа колебаний образа усечённой пирамиды (рис. 155) в различных условиях
Стр. 363
Оборудование: секундомер или часы с секундной стрелкой.
Ход работы:
Попытаемся представить усеченную пирамиду, обращенную усеченным концом к нам и от нас.
Когда оба образа сформированы, они сменяют друг друга: пирамида кажется то обращенной к нам, то от нас.
При каждом изменении образа заносим в тетрадь штриховую черту, не глядя в нее. Отрывать глаза от рисунка нельзя!
По числу колебаний этих образов можем судить об устойчивости внимания. Для экономии времени измеряем число колебаний за 30 секунд и результат удваиваем.
МБУЗ "Патологоанатомическое бюро", Таганрог
Декальцинация в гистологической лабораторной технике
Журнал: Архив патологии. 2012;74(6): 43-45
Пешков М. В. Декальцинация в гистологической лабораторной технике. Архив патологии. 2012;74(6):43-45.
Peshkov M V. Decalcification in histology laboratory techniques. Arkhiv Patologii. 2012;74(6):43-45. (In Russ.).
МБУЗ "Патологоанатомическое бюро", Таганрог
Описана процедура декальцинации, которая может быть применена в любой гистологической лаборатории, работающей с костными образцами для общих и специальных целей. Рассмотрены преимущества и недостатки основных типов декальцинирующих агентов и принципы их выбора для разных типов объектов, а также методы определения окончания декальцинации.
МБУЗ "Патологоанатомическое бюро", Таганрог
Костные образцы считаются одними из трудных объектов для гистологического исследования, так как межклеточное вещество содержит избыток различных солей кальция. Минерализация обусловливает опорно-механическую функцию костной ткани, но именно это обстоятельство представляет известную трудность в практической гистологии.
Для рутинного гистологического исследования наиболее употребимыми являются фиксация в 10% нейтральном забуференном формалине, заливка в парафин и окраска гематоксилином и эозином. Образцы костной ткани требуют удаления кальция и изменения технологии получения парафиновых срезов. Чрезвычайно важным этапом в технологии изготовления гистологических препаратов является фиксация. Предпочтительное использование формалина для фиксации определяется следующими соображениями:
1) это самый часто используемый фиксатор; подавляющее большинство гистологических лабораторий используют один и тот же фиксатор практически для всех гистологических объектов;
2) любой из рутинных образцов может быть подвергнут иммуногистохимическому исследованию, а использование подавляющего большинства первичных антител требует фиксации материала в 10% нейтральном забуференном формалине.
Наличие солей кальция не позволяет приготовить срезы тканей на обычных микротомах, поэтому кальций необходимо удалить перед проводкой ткани (декальцинация). Этой процедуре подвергают не только костные образцы, но любые ткани, содержащие патологические участки обызвествления.
Ниже описаны детали процедуры декальцинации и способы контроля окончания декальцинации, пригодные для современной гистологической лаборатории.
Выбор декальцинирующего агента
Все декальцинирующие агенты можно условно разделить на кислотные и бескислотные.
P. Gray [6] приводит 65 рецептов декальцинирующих жидкостей, каждый из которых включает, как минимум, одну из кислот.
К бескислотным декальцинаторам относятся ионообменные смолы, но они не столь широко используются в гистологии.
Считалось, что для удаления кальция из компактных костей лучше всего подходят декальцинирующие жидкости на основе сильных минеральных кислот (соляная, азотная). Они действительно быстро извлекают кальций (2—3 сут), но такие объекты совершенно не пригодны для иммуногистохимического (ИГХ) исследования.
Считается, что губчатые кости лучше декальцинировать растворами на основе слабых органических кислот (муравьиная, уксусная), но и в этом случае могут возникнуть трудности при проведении ИГХ-окрасок. Процедура декальцинации слабыми кислотами занимает 7—10 дней и более.
В любом случае, когда в лаборатории исследуются опухоли костей и трепанобиоптаты костного мозга, нужно использовать растворы на основе этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) с рН 7,0. Если данная технология недоступна в лаборатории и используется метод декальцинации сильными кислотами, необходимо один репрезентативный кусочек опухоли вместе с костной тканью зафиксировать до процедуры декальцинации и сохранить его либо в 70% этаноле, либо в 70% изопропаноле, но не в формалине.
Процедура декальцинации
Выпиленные образцы толщиной 3 мм помещают в 10% нейтральный забуференный формалин на 24—48 ч при комнатной температуре в объеме фиксатора в 10—20 раз больше образца.
I. Dimmenstein [5] приводит описание некоторых приспособлений и вспомогательных приемов для вырезки костного материала. Перед проводкой избыток формалина отмывается в течение 20—30 мин в проточной воде.
Материал для декальцинации помещают в гистологические кассеты. Декальцинация каждого случая проводится в отдельной пластиковой емкости объемом не менее 200 мл, для контроля выбирают наиболее крупный образец. Процедура проводится без использования каких-либо приспособлений. Подогрев, мешалки, вакуум, микроволны, ультразвук и воздействие электрического поля могут изменить структуру белковых молекул и повредить антигены.
Объем декальцинатора по отношению к объему ткани должен быть, как минимум, в 50 раз больше, поскольку процесс извлечения происходит путем диффузии кальция в раствор. В свежем растворе декальцинация проходит сильнее. Необходимо заменять раствор на свежий ежедневно.
Определение окончания декальцинации
Это очень важный момент, так как он позволяет предотвратить необратимое разрушение тканей. Имеется несколько способов определения окончания процесса декальцинации.
1. Сгибание кусочка. Образец ткани пробуют согнуть пальцами. Пока в нем остается кальций, его очень трудно или невозможно согнуть, а при отсутствии кальция он легко гнется. Это быстрый и простой, но субъективный тест. При сгибании не полностью декальцинированной кости мягкие ткани могут отделяться от твердых, а также происходит повреждение структуры костной ткани. При слишком сильном сгибании ткани ломаются, даже если кальция в них уже нет [2, 11].
2. Проба образца тонкой иглой. Если игла проходит через образец без хруста, декальцинация считается законченной. При этом от иглы остаются следы, и это заметно под микроскопом. Нередко картина нарушается в самых ценных для диагностики местах. Тем не менее игла может проходить без затруднений и в тех случаях, когда в образце кальций еще остается в небольшом количестве [9].
3. Углекислотный тест. При помещении кусочка в декальцинирующую жидкость на поверхности раствора начинают появляться пузырьки углекислого газа. Отсутствие пузырьков газа свидетельствует об окончании процесса декальцинации. Это неточный тест, поскольку при наличии мелких кальцинатов пузырьки газа не визуализируются. Особенно трудно этот тест выполним на мелких костных фрагментах [10].
4. Всплывание образца на поверхность. Образец всплывает на поверхность, когда кальция в нем не остается. Это утверждение неверно, поскольку образец может всплывать независимо от наличия кальция или когда плотность образцов меньше плотности декальцинирующего раствора.
5. Оксалатный тест. Достаточно информативный и чувствительный метод [2, 4], который подходит для сильных и органических кислот, если их концентрация не превышает 10%. Он не подходит для растворов с ЭДТА. Продолжительность теста — 35 мин.
6. Рентгенографический метод. Впервые был описан в 1930 г. [7]. С помощью рентгеновского аппарата (обычного или специального, например, Faxitron) определяются даже минимальные количества кальция в исследуемом объекте. Можно определять отложения кальция и в парафиновых блоках [3]. Недостатки метода — дорогостоящая специальная аппаратура, а также влияние рентгеновского излучения на персонал. Преимущество — возможность тестирования большого количества объектов за короткое время.
7. Гравиметрический тест. Надежный тест, не требующий затрат реактивов, дорогостоящей аппаратуры и времени. Подходит для любого декальцинатора и любого объекта. Если масса объектов мала и они многочисленны, можно взвешивать их вместе. Исследуемый фрагмент промокают фильтровальной бумагой для удаления избытка воды и взвешивают его с точностью до миллиграмма. Массу фиксируют. В дальнейшем образец ткани после просушивания кусочками фильтровальной бумаги ежедневно взвешивают и сравнивают массу с предшествующим результатом. Пока удаляется кальций, масса образца будет убывать [1]. Имеется промежуток времени, когда масса остается постоянной. Как только кальций полностью будет удален, вода начинает замещать кальций, и масса образца начинает увеличиваться. Важно зафиксировать тот момент, когда кальций полностью удален из образца — декальцинация может считаться законченной [8]. После окончания декальцинации исследуемые образцы промывают в воде в течение 30—60 мин и начинают проводку по обычной схеме. Особенно важно выполнить промывку после использования жидкостей на основе ЭДТА, поскольку он при взаимодействии со спиртами образует осадки, значительно затрудняющие микротомию.
Определение момента окончания декальцинации является обязательным, но требует определенного навыка. Эти тесты рационально проводить на каком-либо одном (большем) образце от одного пациента, а не тестировать каждый объект.
Гравиметрический тест является наиболее быстрым, простым, удобным и дешевым. Для крупной лаборатории, постоянно работающей с костным материалом, целесообразно рассмотреть возможность приобретения портативной рентгеновской установки для тестирования момента окончания декальцинации. Оба метода оправдывают себя по затрате времени и простоте исполнения тестов, воспроизводимости и надежности результатов.
Прерывание декальцинации
Возможность прерывания процесса декальцинации является неоспоримым преимуществом в случае, когда процесс близок к окончанию, а возможность завершить его отсутствует (выходные и праздничные дни, ночь и др.). В этом случае кусочки костей извлекают из декальцинирующего раствора, промывают в проточной воде в течение 20—30 мин и помещают в 10% нейтральный забуференный формалин на нужный срок. Возобновляют декальцинацию после извлечения образцов из фиксатора и промывки в проточной воде в течение 20—30 мин.
Необходимо помнить, что декальцинации не подлежат хрящевые образцы, ткани с резко выраженным фиброзом, ногти, ороговевшая кожа и любые другие образцы, не содержащие солей кальция.
Декальцинирующие жидкости не обладают размягчающим действием и приводят к повреждению белковых структур. Декальцинаторы на основе минеральных кислот не могут применяться в тех случаях, когда может возникнуть необходимость в проведении ИГХ-исследований. Особенно это касается трепанобиоптатов костного мозга.
Поэтому группа декальцинаторов на основе сильных минеральных и органических кислот может использоваться только в тех случаях, например, когда нет подозрения на наличие опухолевого процесса, когда исследуют компактную кость.
Органические кислоты (муравьиная и ее соли, уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, лимонная и ее соли) обладают более мягким действием, но требуют для полной декальцинации от нескольких дней до нескольких недель. В современных условиях, когда клиницисты требуют сократить сроки исследования, это вряд ли удобно.
Хелатирующие агенты (ЭДТА и ее соли) — отдельная группа декальцинирующих агентов. Механизм связывания кальция в зависимости от рН раствора можно представить следующим образом. ЭДТА связывает кальций в зависимости от рН за счет четырех карбоксильных кислотных групп (СООН) и двух аминогрупп (NH). При рН ниже 3,0 декальцинация не происходит вообще. При увеличении рН раствора протоны диссоциируют из этих групп. Этот процесс известен как депротонирование, и декальцинация становится возможной. При рН выше 10,0 группы СООН полностью депротонированы, эта форма ЭДТА быстро связывает кальций, и декальцинация происходит очень быстро. Однако при рН более 7,4 происходит необратимый щелочной гидролиз некоторых белков. При рН 7,0 декальцинация будет происходить достаточно эффективно. Детали эксперимента описываются в обзоре G. Callis, D. Sterchi [4].
К сожалению, в большинстве российских лабораторий чаще других используются декальцинаторы на основе сильных минеральных кислот (азотной, соляной), в которых концентрация кислот не превышает 10%. Более высокая концентрация не сокращает время извлечения кальция, а лишь ускоряет гидролиз белков ткани. Поэтому эта группа декальцинаторов подходит для извлечения больших масс кальция за короткое время, например для образцов компактной кости. Обычно время эффективного воздействия таких кислот ограничивается несколькими часами.
В формулах ЭДТА и ЭДТА с солями натрия более растворимы те, в которых больше натрия. Динатриевая соль ЭДТА менее растворима, чем тетранатриевая ЭДТА, но важно заметить, что их рН также отличаются.
Порошки ЭДТА, используемые для декальцинации, бывают нескольких видов.
Б. Динатриевая соль ЭДТА имеет молекулярную массу 372 моль. 5% раствор имеет рН 4,0—5,0 при комнатной температуре. Соль растворяется в воде в концентрации до 10%, но при приготовлении раствора могут возникнуть трудности, пока рН раствора доводится до 7,0 с помощью гидроксида натрия. Наиболее часто применяется динатриевая соль ЭДТА, имеющая молекулярную массу 372,5 моль, раствор при комнатной температуре имеет рН 4,0—5,0:
вода дистиллированная, мл 850,0
ЭДТА динатриевая соль, г 125,0
натрия гидроксид, г 23,0.
Следует растворить динатриевую соль ЭДТА в воде, затем прибавить гидроксид натрия. Все процессы проводить, непрерывно помешивая. рН конечного раствора должен соответствовать 7,0, что достигается прибавлением по каплям 40% водного раствора гидроксида натрия, при помешивании и контроле рН с помощью предварительно откалиброванного рН-метра. Должен получиться совершенно прозрачный раствор, без каких-либо осадков и взвесей.
В итоге, находясь перед выбором декальцинирующего агента, лаборатория оказывается под влиянием следующих обстоятельств:
— неизвестно заранее, какой объект впоследствии будет подвергнут гистохимическому, иммуногистохимическому или молекулярному исследованию;
— клиницисты требуют выдачи результата в максимально короткие сроки;
— декальцинирующий раствор должен быть прост и эффективен, дешев и доступен и не повреждать элементы тканей.
По этим соображениям компромиссным представляется выбор декальцинатора на основе ЭДТА с нейтральной рН.
Заключение
Костные образцы, фиксированные в 10% нейтральном забуференном формалине, могут быть декальцинированы с использованием разных декальцинирующих жидкостей, но с обязательным контролем окончания декальцинации. Такой подход позволяет контролировать качество декальцинации ткани, которая впоследствии будет подвергнута как рутинным, так и ИГХ-исследованиям. Декальцинацию для таких случаев важно проводить растворами на основе солей ЭДТА с нейтральной рН. Если в данной лаборатории ИГХ-методы не выполняются, то макроскопически репрезентативный образец, зафиксированный в 10% нейтральном забуференном формалине, должен сохраняться в 70% этиловом или изопропиловом спирте до тех пор, пока не потребуется ИГХ-исследование. Это чрезвычайно важно для выбора лечебной тактики при гематологических заболеваниях и опухолях костной ткани.
Учитель биологии Апастовской
средней общеобразовательной
школы с углубленным изучением
отдельных предметов
Габидуллина Гульфия Камилевна
2. Форма костей
4. Лабораторная работа Свойства декальцинированной и прокаленной костей
Декальцинированная кость - кость,
которую выдержали в 10% растворе
соляной кислоты, в результате чего
соли кальция растворились
Прокаленная кость - кость, которую
долго держали на огне, в результате
чего вода испарилась, а органические
вещества сгорели
Неорганические вещества составляют 65-70% сухой массы
кости, придают твердость
Органические вещества составляют 30-35% сухой массы
кости, придают костям
эластичность и упругость
6. Строение кости
7. Костная ткань (компактное вещество)
8. Губчатое вещество
9. Строение кости
Полость трубчатых костей
заполнена соединительной тканью
богатой желтым костным мозгом
Головка трубчатых костей
образована губчатым веществом,
промежутки которого заполнены
красным костным мозгом
10. Рост костей
Рост кости в толщину происходит
за счет клеток надкостницы
Рост кости в длину происходит за
счет клеток хрящевой ткани,
покрывающей концы костей
11. Типы соединения костей
12. 1.Костная ткань - это особый тип: а)мышечной ткани б)соединительной ткани в)эпителиальной ткани 2.Рост костей в толщину
происходит за счет:
а)надкостницы
б)хрящей, между телом кости и ее концами
3.Шов - это:
а)неподвижное соединение костей
б)полуподвижное соединение костей
в)подвижное соединение костей
4.Какие вещества придают кости твердость, прочность
а)минеральные
б)органические
5.Назовите железу, которая влияет на рост организма:
а)надпочечник
б)щитовидная железа
в)гипофиз
Большая берцовая кость при
небольшой массе (около 0,5 кг)
может выдерживать нагрузку до
1500кг. Благодаря чему это
возможно?
Читайте также: