Питательная среда мурасиге скуга своими руками

Добавил пользователь Евгений Кузнецов
Обновлено: 04.10.2024

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:

- не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);

- практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;

- не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);

- трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок;

- неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

- получение генетически однородного посадочного материала;

- освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

- высокий коэффициент размножения (105—106 — для травянистых, цветочных растений, 104—105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных);

- сокращение продолжительности селекционного процесса;

- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

- возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума (сем. орхидные) состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал.

В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р. Г. были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов.

Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг.

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре.

В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro. В последующих работах 40-х годов было выяснено о способности различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены. Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных город in vitro долгое время использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др.

Этапы микроклонального размножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений — весна или начало лета.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90° С в течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).

Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20—22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65—90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Через 20—30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.

Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

1. Активация пазушных меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :

а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

б) индукция соматического эмбриогенеза;

в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования.

Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности культивирования in vitro земляники садовой на жидкой среде. Способ включает в себя размножение микропобегов земляники в течение трех недель на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением ключевого компонента сорбитола. Предложенный способ позволяет достичь высокого коэффициента мультипликации земляники садовой на жидкой среде in vitro при малой продолжительности культивирования, а также почти полностью исключить витрификацию. 1 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности размножения in vitro земляники садовой на жидкой среде. Результаты данного изобретения могут быть использованы при получении посадочного материала земляники садовой.

Большинство биотехнологических лабораторий, работающих с культурами in vitro, используют в качестве питательной среды агаризованные среды. В основном среды содержат порядка 6-8 г/л агара. Следует отметить, что стоимость хорошего, подходящего для сред in vitro агара в настоящее время довольно высока и его применение при культивировании растений резко увеличивает себестоимость получаемого посадочного материала и снижает рентабельность производства.

В качестве достойной альтернативы способов размножения на агаризованных средах разрабатываются способы размножения растений на жидких питательных средах. Жидкие среды способствуют хорошей аэрации и поглощению поверхностного кислорода. Кроме того, в них более равномерно идет распределение всех питательных веществ и растворение токсических метаболитов. Применение жидких сред увеличивает площадь поверхности контакта ткани и питательной среды, обеспечивая, тем самым, активизацию процесса дыхания, а также благоприятствует процессу синтеза белка и поглощению солей. Среди ключевых недостатков использования жидких сред можно отметить возможное изменение значения рН в течение культивирования, а также витрификацию, которая очень сильно снижает качество микропобегов и может вызывать гибель растений (Preil, W. 2005. General introduction: a personal reflection on the use of liquid media for in vitro culture. Pages 1-18 in А.К. Hvoslef-Eide and W. Preil, eds. Liquid culture system for in vitro plant propagation. Spriger Verlag, Berlin, Germany). Поэтому разработка состава жидких сред для культур с одновременным сокращением продолжительности культивирования позволит повысить эффективность размножения растений.

Земляника является одной из наиболее значимых культур в ягодоводстве и в настоящее время она культивируется практически во всем мире. Земляника может расти в различных почвенно-климатических условиях, плодоносит в год посадки или на следующий год, созревает раньше большинства других плодовых и ягодных культур, дает высокие урожаи крупных, привлекательных, вкусных и ароматных ягод. Биохимический состав ягод определяет их пищевую и лечебную ценность. Таким образом, содержание в ягодах полезных для здоровья людей веществ и отличный вкус предопределяют востребованность земляники на рынке в свежем, замороженном и переработанном виде. Одним из способов получения посадочного материала земляники является ее размножение в условиях in vitro.

Недостатками использования данного способа являются длительный период культивирования (8 недель), высокая витрифицированность растений (до 30%), а также высокая стоимость цитокинина тидиазурона, который к тому же усиливает появление сомаклональных изменений.

Наиболее близким известным прототипом является способ культивирования земляники садовой в биореакторе с использованием жидкой среды следующего состава: среда Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП, 0,05 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,03 мг/л гиббереловой кислоты и 30 г/л сахарозы (L. Georgieva, I. Tsvetkov, М. Georgieva and V. Kondakova. New protocol for in vitro propagation of berry plants by tis bioreactor, Bulgarian Journal of Agricultural Science, 22 (5) 2016, 745-751).

К недостаткам ближайшего прототипа следует отнести умеренный коэффициент мультипликации (4,0) и время культивирования, не отличающее от использования агаризованных питательных сред (4 недели).

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности размножения земляники садовой на жидкой среде с одновременным сокращением продолжительности культивирования и сохранением качественных характеристик растений.

Поставленная цель достигается за счет использования жидкой среды Мурасиге-Скуга (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) с добавлением 0,2 г/л 6-БАП, 20 г/л сахарозы и 10 г/л сорбитола, оказывающего в данной концентрации защиту от витрификации.

Суть изобретения состоит в том, что растения земляники садовой культивируются в колбах Эрленмейера на шейкере, с качающимся типом платформы, на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга для мультипликации, а именно с добавлением 0,2 г/л 6-БАП, 20 г/л сахарозы и 10 г/л сорбитола и переносятся на свежую питательную среду через 3 недели.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. В нестерильных условиях готовится жидкая питательная среда Мурасиге-Скуга. В нее добавляются необходимые количества макро- и микроэлементов, 10 г/л сорбитола, 20 г/л сахарозы, объем доводится дистиллированной водой с подведением значения рН до 5,6-5,8. Среда разливается по 30 мл в колбы Эрленмейера объемом 250 мл, запечатывается фольгой и бумагой, завязывается резинкой. Автоклавирование проводится при 1 атм и 120°С в течение 20 минут. В остывшую среду стерильно вносятся раствор витаминов Мурасиге-Скуга и регулятор роста 6-БАП в концентрации 0,2 г/л. Все манипуляции с растительным материалом производятся в стерильных условиях ламинара. В колбу со средой вносятся 5 эксплантов длиной не менее 1 см каждый. У каждого экспланта предварительно убираются нижние листья (2-3 листа).

2. В течение трех недель проводится культивирование растений на жидкой среде в колбах Эрленмейера на шейкере с качающимся типом платформы со скоростью 100 оборотов в минуту, при освещении 1000 лк в течение 14 часов.

2. Через 3 недели производится срезка побегов для последующего укоренения, а оставшиеся нижние части растений пересаживаются на свежую питательную среду.

Техническим результатом предлагаемого способа является достижение высокого коэффициента мультипликации земляники садовой, равного 5,0, при коротком, трехнедельном периоде культивирования, а также низкий уровень витрификации растений (Таблица 1).

Изобретение может быть использовано для быстрого получения качественного и здорового посадочного материала, при этом действие изобретения распространяется на широкий спектр сортов земляники садовой, предлагаемых биотехнологическими лабораториями и предприятиями на российский рынок, в том числе на популярные, но медленно размножающиеся, в силу своих сортовых особенностей, сорта, такие как: Гигантелла Максим (Gigantella Maxim), Редгонтлет (Red Gauntlet), Роман (Roman).

Полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известными способами. Предложенный способ обеспечивает повышение эффективности размножения земляники садовой с коэффициентом мультипликации до 5,0 при одновременном снижении длительности культивирования и уровня витрификации микропобегов (таблица 1).

Способ размножения земляники садовой in vitro, включающий культивирование эксплантов земляники на жидкой питательной среде, отличающийся тем, что питательная среда содержит макроэлементы, микроэлементы и витамины по Мурасиге-Скуга, 0,2 мг/л 6-БАП, 20 г/л сахарозы, 10 г/л сорбитола, в качестве эксплантов используются побеги длиной не менее 1 см с удаленными 2-3 нижними листьями и длительность культивирования составляет три недели

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Для микроклонального размножения картофеля проводят размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании безгормональной питательной среды с рН 5,7-5,8, содержащей микросоли и макросоли по Мурасиге и Скуга, Fe2SO4, CaCl2, мезо-инозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, сахарозу, глюкозу, агар, биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii при следующем соотношении компонентов:Макросоли - 50 мг/л,Микросоли - 1 мг/л,Fe2SO4⋅7H2O - 5,0 мг/л,CaCl2⋅2H2O - 440 мг/л,мезо-инозит - 100 мг/л,тиамин - 1,0 мг/л,пиридоксин - 1,0 мг/л,никотиновая кислота - 0,5 мг/л,сахароза - 25 г/л,глюкоза - 25 г/л,агар - 6 г/л,биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii - 0,5 мг/л.Изобретение позволяет повысить эффективность размножения здоровых пробирочных растений картофеля.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к растению Cucumis melo, способному производить более чем 12 плодов, где указанные плоды являются бессемянными, к части вышеуказанного растения, а также к пищевому продукту, содержащему вышеуказанное растение или его часть.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к растению Eustoma, имеющему цитоплазматическую мужскую стерильность, а также к его части, семени, каллусу, митохондрии.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ ранней диагностики деревьев сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости, основанный на использовании каллусных культур in vitro, культивируемых в условиях моделируемой засухи (1% NaCl) на питательной среде MS с добавлением 3% сахарозы, уменьшенным содержанием витаминов (В1 - 0,5 мг/л, аскорбиновая кислота - 0,4 мг/л, пиридоксин и РР исключены), гормонов 6-БАП (0,5 мг/л), НУК (2 мг/л), с дифференциацией культур через 10-15 суток культивирования по признаку жизнеспособности: отсутствие некротической ткани - засухоустойчивое исходное дерево, 100% некротизация - неустойчивое к засухе.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет себе способ ограничения доли семян самооплодотворяемых мужских растений, получаемых с поля, содержащего насаждение более низкорослых женских опыленных растений (с мужской стерильностью) и насаждение более высокорослых растений с мужской фертильностью, где способ включает пропускание инструмента, проходящего выше высоты более низкорослых женских растений, между периодом цветения и сбором урожая, при этом инструмент применяет химическое вещество в отношении более высокорослых растений с мужской фертильностью, при этом происходит предотвращение или ослабление нормального развития растений с мужской фертильностью, превышающих эту высоту, и разделение семян по плотности для удаления нежелательных самоопылившихся семян мужских растений после сбора семян.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro, включающий выращивание растений-доноров, стерилизацию метелок, посадку пыльников на питательную среду, получение каллуса, перенос его на регенерационную питательную среду, получение регенерантов и их укоренение на питательной среде.

Изобретения относятся к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду, содержащую макро- и микросоли, готовящуюся по прописи WPM, но с дополнительным введением глицина и агар-агара, а также отличным содержанием микро- и макрокомпонентов, N6-(2-изопентил)аденина и индолилуксусной кислоты.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности ризогенеза растений in vitro, заключающийся в том, что экспланты базальной частью высаживают на питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательный раствор для выращивания картофеля в аэропонике, содержащий в 1 л воды: кальциевая селитра (нитрат кальция) - 1 г, фосфат калия однозамещенный - 0,25 г, сульфат магния - 0,25 г, хлорид калия (калийная соль) KCl - 0,125 г , хлорид железа - 0,0125 г, борная кислота - 19,63 г, марганец сернокислый - 14,00 г, цинк сернокислый - 1,41 г, медь сернокислая - 1,41 г, микробиологический препарат - 5 мл, обладающий широким спектром воздействия на фитопатогенные микроорганизмы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, их размножение и укоренение, где на этапе собственно микроразмножения чередуют питательные среды через один пассаж, содержащие MS + (2,5-10,0) мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК и MS + 1 мкМ БАП + 100 мг/л L-глютамин + 100 г/л аденин сульфат, полученный посадочный материал выращивают в гидропонной установке промышленного образца на питательной среде MS, содержащей половинный набор макросолей и микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого.

Любая ткань растений - это сообщество клеток, и если она изолирована (выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей (клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения их полноценного питания и развития.

Тогда при строгом соблюдении этих условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные исходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использования. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических условиях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации ее генетической информации.

Смещая в эксперименте временную реализацию генетической информации (с помощью гормональных воздействий), можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремальных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направлении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую неустойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетерогенностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут быть исходным материалом для селекции.

Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера), микроэлементы - в микромолярных (железо, бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина, мезоинозит и др.).

В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и твердые питательные среды.

Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН среды может варьировать от 5,2 до 6,6.

Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения.

Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10 М. Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера.

Микроэлементы составляют в среде концентрации 10-6 М. Присутствие их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы.

Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор.

Органические составляющие сред. Согласно многочисленным данным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей подсолнечника, табака, топинамбура и др.

В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина - источник аминокислот.

В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин.

Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы -токсичны, L-формы - пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетающее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде.

Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензионных культурах.

Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в большинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию.

Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл.

При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлорофилла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращивать на питательной средах, содержащих сахар.

При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на питательную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться.

Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани, взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде. При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообразующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара. Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани.

Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной среде составляет 2-5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахарозы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культивирования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур (травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с глюкозой.

На третьем месте по эффективности использования культурами тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста 2/3 культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и органов растений.

В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более богатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос приводит к некрозам тканей.

Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влияние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увеличении осмотического потенциала среды.
Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие сахаров. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается образование веществ, стимулирующих рост тканей.

Выращивание хлорофиллоносных и лишенных хлорофилла тканей на свету или в темноте изменяет как содержание растворимых сахаров в ткани, так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света также сказываются на углеводном метаболизме тканей.

Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синтезируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследования показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.

В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами. По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после слабого роста ткани в предыдущем пассаже.

Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи метаболизма различно.

Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды.

Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственными средами.

В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.

Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред определяется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1, табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие количества калия, фосфора и микроэлементов.

Таблица 4.1. Примеры составов наиболее употребляемых питательных сред для культивирования растительных клеток тканей

В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток. Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1), отличающиеся набором отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и российскими фирмами.

Таблица 4.2. Состав среды Мурасиге-Скуга

МС - самая универсальная среда, пригодная для образования и роста каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников.

Материалы и оборудование. Химические стаканы, колбы, мерные цилиндры от 5 мл до 2 л, пробирки, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг, пинцеты, ножницы, шпатели, электроплитки, магнитные мешалки, химические реактивы или готовые маточные растворы макро- и микросолей, витаминов, фитогормонов.

В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированной водой до 400 мл и растворить.
Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.
Приготовить агар: навеску 7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл, растворить, нагревая плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.
Питательную среду довести до нужного объема (1 л) дистиллированной водой. Измерить pH среды: если pH превышает 5,5-6,0 добавить несколько капель 0,1 н HCl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН.
Готовую питательную среду разлить в колбы, около 25мл, закрыть их фольгой.
Поместить колбы в автоклав и проавтоклавировать.
Металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при t o 170-200 o С в течение 2 часов.
Чашки Петри, колбы с питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) поместить в автоклав.
Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течении 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1-0,2 атм. Довести давление в стерилизационной камере до 1 атм., включить автоматический режим.
Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1-1,2 атм.
Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм.
Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.

4. Типы эксплантов:

Способы получения и методы стерилизации
4.1. Выделение апикальных меристем

В культуре тканей можно размножать растения и получать оздоровленный (безвирусный) посадочный материал. Для оздоровления растений используют культуру апексов или культуру апикальных меристем, так как в стеблевой апекс вирусы проникают медленнее, чем в другие части растений. При культивировании апексов размножение вирусов подавляется реакцией растительного организма на травму, вызванную отсечением верхушки.

В in vitro используются апексы верхушечных и боковых почек (точек роста), кончиков корней (особенно проростков). Апикальная меристема — группа меристематических (образовательных) клеток , организованных в ростовой центр, занимающая терминальное положение в побеге или корне и обеспечивающая образование всех органов и первичных тканей. Верхняя часть апикальной меристемы представлена инициалями (единственной клеткой — у хвощей и многих папоротников и многоклеточной структурой — у семенных растений ). Ближайшие производные инициальных клеток часто выделяют в зону протомеристемы. Вслед за ней лежат ткани, уже частично дифференцированные, но всё ещё находящиеся в меристематическом состоянии, которые относят к частично детерминированной первичной меристеме. В зависимости от производимых ею систем тканей детерминированная меристема включает следующие клеточные комплексы: тунику, образющую в дальнейшем первичную покровную ткань (эпидермис) и часть первичной коры , и корпус, клетки которого постепенно формируют комплекс проводящих тканей (центральный цилиндр); в корне — дерматоген, дифференцирующийся в первичную покровную ткань (ризодермис); периблему — будущую первичную кору; плерому — центральный цилиндр. Таким образом, будущий ход развития меристематических тканей частично детерминирован уже самим размещением их в апексе побега и корня.

Обычно на питательные среды высаживают небольшую часть меристемы до 0,5 мм. В целом закономерность такова: чем меньше величина меристемы, тем больше вероятность получения безвирусных растений. Ее выделение осуществляется в ламинар-боксе с использованием препаравальных инструментов под увеличением бинокулярного микроскопа.

Рис. Апикальная меристема в верхушечной почке побега элодеи (Elodea canadensis):

А - продольный разрез; Б - конус нарастания (внешний вид и разрез); В - клетка первичной меристемы; Г - клетка из сформировавшегося листа (1 - конус нарастания, 2 - первичный бугорок, 3 - вторичный бугорок - бугорок пазушной почки, 4 – примордии - зачаточные листьев).

Фото Апикальная меристема лилейника

Рис. Апикальная меристема в кончике корня:

1 - калиптроген, 2 - дерматоген, 3 - периблема, 4 - плерома, 5 - ряд клеток, из которых образуется стела, 6 - сброшенные чехликом клетки, 7 - колумелла.
Культивирование растений из апикальных меристем позволяет получать безвирусный оздоровленный посадочный материал практически всех сельскохозяйственных культур. Наиболее полно разработана технология получения безвирусного картофеля. Так система первичного семеноводства и оздоровления посадочного материала картофеля включает следующие этапы: подготовка клубней для вычленения апикальных меристем, вычленение апикальных меристем, регенерация растений из меристем, адаптация растений-регенерантов в защищенном грунте, получение первой продукции безвирусного материала в открытом грунте, выращивание безвирусного посадочного материала в первичных звеньях семеноводства, сохранение коллекции сортов.

В культуре тканей используются апексы верхушечных и боковых почек. Чтобы исключить влияние метаболитов клубня на проростки и повысить регенерационную способность исходного материала из средней части клубня вырезают глазки с частью паренхимы (1,5 х 1,5 см). Глазки проращивают на песке, предварительно обработанном сухим жаром. Этиолированные проростки выращивают в темноте при температуре 25±2 о С, влажности воздуха 70-80 %. Песок дважды в день увлажняют, через 7-10 дней проводят подкормку раствором Кнопа.

Апикальные меристемы проростков изолируют на 12-13 пластохроне (промежуток времени между инициациями двух листовых бугорков). Изолированные меристемы культивируют в асептических условиях на питательных средах с богатым содержанием макро- и микросолей, с повышенной концентрацией цитокининов (6-БАП 2 мг/л). В культуральной комнате с кондиционированным воздухом поддерживают температуру 25±2 о С, влажность воздуха 70 %, освещенность 5 кLx и фотопериод 16 часов.

В среднем от посадки меристемы на среду до формирования проростков с 5-6 листочками проходит 30-45 дней, в некоторых случаях от 2 до 8 месяцев. Среды по мере истощения обновляют, и проростки периодически пересаживают на новые среды в стерильных условиях.
4.2. Выделение клеток, их групп и тканей.

Регенерацию растений из культуры тканей можно получить, используя один из трех методов: культуру зародышей, органогенез, соматический эмбриогенез. Соматический или неполовой эмбриогенез представляет собой процесс формирования зародышеподобных структур из соматических клеток. Соматический зародыш - это независимая двухполюсная структура, физически не прикрепленная к ткани, из которой она происходит. Такие зародыши в дальнейшем могут развиваться и образовывать регенеранты через стадии, соответствующе тем, что встречаются при развитии зиготы. Подобное явление можно встретить у многих видов растений в условиях in vitro при работе с культурами различных типов клеток, тканей и органов, тогда как в природе такие процессы происходят внутри семяпочки.

При соматическом эмбриогенезе переноса каллуса на среду без регуляторов роста обычно бывает достаточно для стимуляции более поздних стадий развития зародыша и его последующего прорастания. Образование соматических зародышей из культур клеток, тканей и органов может происходить прямым или непрямым путем. Прямой соматический эмбриогенез заключается в формировании вегетативного зародыша из одной или нескольких клеток ткани экспланта без стадии образования промежуточного каллуса. Такое явление наблюдается у цитрусовых, где ткани нуцеллуса дают начало нуцеллярным зародышам. Есть данные о прямом эмбриогенезе в некоторых культурах пыльников и протопластов. Однако по сравнению со случаями непрямого эмбриогенеза эти случаи редки.

Непрямой эмбриогенез состоит из нескольких этапов: помещения экспланта в культуру, последующей стимуляции роста каллуса и формирования предзародышей (обычно на среде, содержащей высокие концентрации ауксинов), и переноса каллуса на питательную среду без регуляторов роста, для того чтобы индуцировать формирование биполярных зародышей из предзародышей. При подходящих условиях эти зародыши прорастают и образуют растения - регенеранты. Каллус по своей природе гетерогенен и может состоять из клеток многих типов, включая инициали предзародышей. Инициали предзародышей могут состоять из одной клетки или представлять собой многоклеточные образования. Когда каллус переносят на среду с низким содержанием ауксина, происходит процесс дальнейшего эмбриогенеза, при котором образуется большое число предзародышёй, а ранее сформировавшиеся инициали предзародышей развиваются в биполярные зародыши. Развитие зародышей происходит асинхронно.

Формирование соматических зародышей может быть достигнуто путем использования соответствующей питательной среды, условий культивирования и отбора экспланта. Соматический эмбриогенез моркови представляет собой классический пример регенерации растений по типу непрямого соматического эмбриогенеза. У моркови практически любая часть растения (корень, черешок листа, лист, стебель или зиготический зародыш) продуцирует эмбриогенный каллус. Из свежеизолированных эксплантов моркови и из линий каллусных клеток путем манипуляций со средой культивирования можно индуцировать образование соматических эмбриоидов. При развитии этих соматических эмбриоидов наблюдаются типичные стадии развития (глобула и торпедо). совпадающие со стадиями развития оплодотворенной яйцеклетки в зародышевом мешке развивающегося семени моркови. Это явление может служить одним из доказательств тотипотентности клеток высших растений. Морфогенетическая способность клеток в культуре клеток при продолжительном культивировании обычно изменяется. В клетках моркови, например, она может полностью пропадать через 30-40 недель после изолирования экспланта, но изменением состава сред культивирования ее можно возвратить. Это означает, что генетическая информация, необходимая для эмбриогенеза, всегда присутствует в клетках и, что существуют определенные эпигенетические факторы, которые необходимы для регуляции соматического эмбриогенеза в культуре клеток моркови. В данной работе изучают эффект двух компонентов среды культивирования на соматический эмбриогенез в закончивших рост каллусных линиях моркови.
4.3. Получение микрочеренков

Использование микрочеренков при клональном размножении растений in vitro имеет наиболее широкое распространение. В качестве черенков чаще всего используются просыпающиеся почки или верхушки молодых побегов. В некоторых случаях используются листовые черенки – растения способные продуцировать особи из фрагментов листьев или их черешков (сенполии, стрептокарпусы, бегонии королевские, сансивьеры и др.)

Фото Типы стеблевых черенков для введения в in vitro

Фото Типы листовых черенков для введения в in vitro

4.3. Получение микрочеренков.

Использование микрочеренков при клональном размножении растений in vitro имеет наиболее широкое распространение. В качестве черенков чаще всего используются просыпающиеся почки или верхушки молодых побегов. У корневищных многолетников (хосты, ветреницы, астильбы, акониты и др.) используют подземные почки корневища. У луковичных листовые чешуи (лилии) или центральные почки (нарциссы, тюльпаны) луковиц. В некоторых случаях используются листовые черенки – растения способные продуцировать особи из фрагментов листьев или их черешков (сенполии, стрептокарпусы, бегонии королевские, сансивьеры и др.). При этом главным является отбор черенков на начальных этапах сезонного роста. В этот период их инфицирование значительно меньше и повышенный гормональный фон способствует более эффективному введению.

Этот способ размножения основан на формирование адвентивных почек и побегов. Способность к индукции адвентивных почек в обычных условиях встречается у некоторых видов растений (например, в роде бегония). Такая индукция в значительной степени определяется содержанием гормонов в среде или регулярным механическим повреждением верхушечной почки механически (срезкой верхушек). Результат - снятие апикального доминирования и закладка адвентивных почек. Этот метод уже стал промышленным при производстве посадочного материала некоторых культур. Эта модель наиболее детально была отработана на картофеле.

При работе с картофелем чаще всего пользуются черенкованием. Для этого выросший в пробирке из меристемы побег расчленяют с соблюдением стерильности на фрагменты размером 0,5-1,0 см, каждый из которых должен иметь листочек и пазушную почку.

Эти черенки сразу же помещают на питательную среду того же состава для доращивания и укоренения. При этом среда может быть как плотной (т.е. с агаром), так и жидкой. Как только высаженные черепки сформируют из пазушной почки новый побег, последний вновь черенкуют.

С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.

Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи.

Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Nа), бром (бромной водой), tween-20, перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками. Следует подбирать такие концентрации стерилизующих агентов, которые не повреждали бы сами семена, не угнетали их всхожесть и обеспечивали максимальную стерильность.

Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.

Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут.

Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3 % раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.

Хлорамин применяют в концентрации 1-6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена – 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.

Сулема – токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1-3 минут, для корне- и клубнеплодов – до 10-20 минут.

Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.

Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.

Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие.

В качестве стерилизующего агента применяют также перекись водорода, которая менее всего повреждает экспланты и после которой не требуется отмывка в стерильной воде, так как она быстро разлагается.

Стерилизацию эксплантов необходимо проводить в стерильных (асептических) условиях: в ламинар-боксе.

Колбы с эксплантами после помещаются в абсолютную темноту при комнатной температуре на неделю для выявления степени стерильности. Те колбы, в которых началось заражение, следует сразу удалять.
Лабораторная работа № 3

Читайте также: